Массовое параллельное секвенирование РНК плазмы крови человека
РНК являются одним из наиболее многофункциональных биополимеров. РНК участвуют в переносе и реализации генетической информации, транспорте аминокислот, направляют и осуществляют ферментативные реакции. Известно, что внеклеточные жидкости высших организмов содержат РНК. Исследование структуры и биологических функций циркулирующих внеклеточных РНК расширяет фундаментальные знания в области межклеточной коммуникации и путей сигнализации, а также способствует разработке новых диагностических и терапевтических подходов.
Целью данного исследования является детальное описание структуры и форм внеклеточных РНК плазмы крови человека методом массового параллельного секвенирования на платформе SOLiD™, направленное на выявление новых форм регуляторных РНК и установление механизма их действия, разработку новых уникальных и комплексных диагностических маркеров заболеваний человека.
Суммарную РНК выделили из образцов плазмы крови 8 здоровых доноров - 4 мужчин и 4 женщин, в возрасте от 20 до 60 лет. Для получения полных кДНК библиотек циркулирующие РНК подвергали дефосфорилированию с последующим 5'-фосфорилированием. Молекулы РНК с 3'-гидроксильной и 5'-фосфатной группами лигировали с адаптерами и подвергали обратной транскрипции. Полученные 8 персонализированных кДНК библиотек амплифицировали и секвенировали на платформе SOLiD™. Полученные последовательности длиной 35 нуклеотидов (в количестве от 31 до 65 миллионов на библиотеку) выравнивали с известными последовательностями ДНК и РНК человека, классифицировали и количественно сравнивали двумя независимыми подходами, с помощью программного обеспечения BioScope™ и Bowtie/Cufflinks.
Было обнаружено, что совокупность РНК плазмы крови человека представляет собой набор фрагментов рРНК, мРНК, транскриптов митохондрий, мкРНК, мцРНК, мяРНК, мяоРНК, а также не аннотированных ранее транскриптов. Вклад фрагментов митохондриальных транскриптов в общий набор циркулирующих РНК, а также высокая плотность покрытия последовательностей мтДНК указывают на присутствие в системной циркуляции митохондрий в составе апоптотических телец. Сравнение представленности отдельных форм мкРНК с данными литературы позволяет предположить, что существенную часть РНК плазмы крови составляют РНК экзосом и микровезикул. Набор предполагаемых мРНК мишеней циркулирующих мкРНК указывает на то, что мкРНК плазмы крови участвуют в регуляции гемопоэза. Расширенный анализ найденных последовательностей позволил выявить следовые количества вирусных и бактериальных транскриптов в системной циркуляции.
Полученная база данных последовательностей РНК плазмы крови здоровых доноров является основой для поиска и разработки новых диагностических РНК-маркеров заболеваний человека, а также открывает новые аспекты межклеточного обмена информацией.
Работа поддержана грантами: РФФИ № 10-04-01386-а, РФФИ № 10-04-01442-а, ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» № 02.740.11.0715
К списку докладов
