Бондаренко Г.Н.   Политов Д.В.  

Изменчивость конформации фрагментов мтДНК некоторых представителей р. Pinus по данным SSCP-анализа

Докладчик: Бондаренко Г.Н.

В настоящее время получение данных о последовательностях нуклеотидов в молекуле ДНК стало ключевым инструментом в филогенетических, филогеографических, популяционно-генетических и экологических исследованиях. Однако использование для этих целей секвенатора делает решение данной задачи дорогостоящим и трудоемким, особенно в области популяционной генетики, где необходимо анализировать выборки большого объема. Метод SSCP (Single-Stranded Conformation Polymorphism – полиморфизм конформаций однонитевых фрагментов) позволяет технологически просто, недорого и с высокой степенью чувствительности выявлять однонуклеотидные замены, влияющие на конформацию молекулы ДНК после ее денатурации и последующей ренатурации. Такой подход, основанный на изменении электрофоретической подвижности молекул ДНК, позволяет значительно сократить количество образцов для секвенирования, которое служит лишь для выявления и описания полиморфизма, в то время как массовый анализ можно проводить на стандартном электрофоретическом оборудовании и недорогих реагентах.
Мы исследовали полиморфизм фрагментов митохондриальных генов nad1 (ген субъединицы 1 NADH-дегидрогеназы, длиной 350 п.н.), nad3 (ген субъединицы 3 NADH -дегидрогеназы, 214 п.н.), rps14 (ген 14 субъединицы рибосомального белка, 282 п.н.) и cob (ген апоцитохрома b, 306 п.н.) в природных популяциях сибирской кедровой сосны Pinus sibirica Du Tour, кедрового стланика P. pumila (Pall.) Regel и сосны обыкновенной P. sylvestris L. Сосна обыкновенная отличается от остальных изученных видов по фрагменту nad3, у этого вида «бэнды» однонитевых конформаций расположены ближе друг к другу, чем у сосны кедровой и стланика. Обнаружены межвидовые различия между кедровым стлаником и сосной кедровой сибирской по фрагменту rps14. На электрофореграмме однонитевые конформационные варианты у стланика расположены гораздо ближе друг к другу, чем у сосны кедровой сибирской. Как и по остальным исследованным фрагментам, по rps14 внутривидовых различий не выявлено, в том числе у P. pumila между популяциями, произрастающими в районе оз. Баунт (северо-восток Бурятии) и в Оймяконе (Саха-Якутия).
Таким образом, применение метода SSCP в лесной генетике может послужить основой рутинного выявления точечных (однонуклеотидных) замен, анализа изменчивости фрагментов ДНК, имеющих одинаковую длину и, на основе этого – видовой идентификации близких видов растений без применения секвенирования. Следует отметить ценность такой диагностики при отсутствии надежных и полных морфологических данных, в том числе при  использовании гербарных образцов и в других случаях, когда морфологические и анатомические видовые признаки недоступны для анализа. SSCP-спектры ядерных, митохондриальных и хлоропластных фрагментов могут также применяться как генетические маркеры для оценки параметров внутривидовой генетической структуры. Однако наша попытка выявить такие полиморфные фрагменты мтДНК в пределах изученных выборок трех видов лесообразующих хвойных пока не дала позитивных результатов. На следующем этапе планируется продолжить анализ мтДНК и ряда фрагментов ядерной ДНК хвойных.
Работа поддержана программами фундаментальных исследований Президиума РАН «Биологическое разнообразие» (подпрограмма «Генофонды и генетическое разнообразие»), и ОБН РАН «Биологические ресурсы России оценка состояния и фундаментальные основы мониторинга», а также ФЦП «Научно-педагогические кадры инновационной России» (направление 1.1, Госконтракт 02.740.11.0281).
 


К списку докладов